化学科普|神奇的“红线”，抗原检测的原理（胶体金法）2023高考考点！
新冠病毒抗原检测板上面分为四个部分。第一部分是样品孔，第二部分是胶体金纳米颗粒与新冠病毒抗体①的偶联物，第三部分是固定有新冠病毒抗体②的条带（标记为T，即Test，检测线），第四部分固定的是能特异性结合新冠病毒抗体的另一种抗体（标记为C，即Control，质控线）。
加样后，样品向前流动，抵达第二部分时，若样品中含有新冠抗原，胶体金偶联的新冠病毒抗体①会识别并结合新冠抗原，样品继续向前流动，到达T线时，T线的新冠病毒抗体②也会结合新冠抗原。即形成“T线抗体②—待测抗原—胶体金偶联抗体①”的三元复合物，大量的胶体金在此处固定，显示出红色条带，判断为阳性。如果样品中没有新冠抗原时，T线的新冠抗体是无法抓住胶体金偶联抗体的，T线不显色，并判断为阴性。
样品向前流动带动胶体金颗粒向前移动，过量的胶体金颗粒到达C线后，其偶联的新冠病毒抗体①与C线的抗体结合，大量积聚后显色红色。若C线出无红色条带，说明抗原检测板质量出现问题，检测结果不可信。
“抗原检测”检测的是什么？
病毒就像一颗包裹着橡皮糖夹心的什锦软糖。
“橡皮糖夹心”位于病毒体的中心，主要成分为核酸（ssRNA），为病毒的复制、遗传和变异提供遗传信息。外层的“软糖”是病毒体的蛋白质外壳，称“核衣壳”（N），可保护病毒核酸免受外界因素的破坏，并能介导病毒进入宿主细胞。而入口之前，“软糖”外包裹的一层“糖衣”便可以理解为病毒体的包膜，它是包绕在病毒核衣壳外面的双层膜。
新型冠状病毒的这层“糖衣”异常绚丽，其膜上有刺突糖蛋白（S）、包膜蛋白（E）和膜蛋白（M）。在这些结构蛋白中，N蛋白在不同SARS-CoV-2病毒株系中高度保守，且具有良好的免疫原性，为病毒侵染细胞后表达量最高的结构蛋白，是良好的检测生物标志物。目前，新型冠状病毒抗原检测一般以检测N蛋白为主。
新冠病毒抗原检测原理
假设这是一份存在新冠病毒特定抗原（N蛋白）的口咽/鼻咽拭子，经拭子处理液的释放洗脱后，N蛋白随着处理液被滴入样品孔。
待测样本在纸纤维所形成的毛细力拉动下，从试纸的一端流向另外一端。在此过程中，N蛋白将经历三道关卡。
备注：第一关卡：金标抗体（金标记2019-nCoV抗体）；第二关卡：T线抗体（2019-nCoV抗体）；第三关卡：C线抗体（“金标记2019-nCoV抗体”二抗）。
样本在毛细管作用下沿着检测卡加样孔端向前移动，如果样本中含有新型冠状病毒抗原，抗原将结合胶体金标记的新冠 N 蛋白抗体 MAb1，形成新冠病毒抗原-胶体金标记抗体复合物，复合物随样本继续迁移到硝酸纤维素膜上，被固定在硝酸纤维素膜上的另一个新冠 N 蛋白抗体 MAb2 抗体捕获，形成紫红色的检测线（T 线），显示新型冠状病毒抗原阳性；如果检测线（T 线）不显色，则表示新型冠状病毒抗原阴性。检测卡中还包含一条质控线 C 线，无论样本中是否含有相应的待测物，紫红色的质控线（C 线）都会出现，用于判读层析过程是否正常。
质控: 用于判断是否有足够样本，层析过程是否正常，金标新冠抗体随液体层析到质控区(C)时被羊抗鼠新冠抗体捕捉形成金标新冠抗体-抗新冠抗体复合物，在质控区(C)形成红色条带。
新冠抗原居家自测步骤：
1.洗净双手，拿出检测卡、采样拭子、提取液等物品，检查是否在有效期内。
2.头部微扬，插入双侧鼻腔（1-1.5厘米），轻轻转动（4次），并停留足够的时间（15秒）
3. 将取好的拭子浸泡在样本提取液里面（20秒），挤压拭子（5次），使得拭子上的样本充分与提取液混合均匀。
4. 折断拭子头，将加样的盖子盖回提取液管。
5. 取出新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测卡，检查是否在有效期内，并将其水平放置在台面上
6. 垂直加样4滴到加样孔中，计时15分钟并等液体自然扩散，在等待的时候避免移动检测卡。
7. 等待15分钟后观察结果
C区 | T区 | 结果判断 |
红杠 | 红杠 | 阳性（+） |
红杠 | 无 | 阴性（-） |
无 | 红杠 | 无效 |
无 | 无 | 无效 |
8. 检测完毕，将所有东西收到垃圾袋里，妥善处理。
1 胶体金
胶体金即胶体纳米金，是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂（如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等）作用下，聚合成一定大小的金颗粒，在静电的作用下成为稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液。
2023年高考考点
胶体金标记主要包括三种作用力，即静电作用、疏水作用及金硫键。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合。由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。
2 乳胶微球
乳胶法是以彩色乳胶微球作为载体的间接凝集试验。吸附可溶性抗原在其表面，特异性抗体与之结合后，产生凝集反应。目前，常用的免疫层析用彩色微球多为采用内部包埋法制备而得，染料处于微球内部，不易泄露，有比较稳定的形态结构。
用于免疫层析产品中的彩色乳胶微球的粒径比胶体金颗粒大（彩色乳胶微球粒径在200nm-400nm，胶体金粒径在20-40nm），相对灵敏度更高。
乳胶微球的颜色鲜艳，并且能够包被氨基、羧基、硫基等多种官能团，因此，既可以通过化学反应形成共价键的形式偶联抗体也可以通过吸附的方式偶联抗体（胶体金仅可通过吸附的方式偶联抗体）。对于含有多个硫原子类的分子，用乳胶微球的标记效果更好。
胶体金法和乳胶法的操作流程基本类似，以双抗夹心法为例：
双抗夹心法演示
3 荧光微球
荧光微球是指将荧光物质，比如荧光素，通过物理和化学等方法标记在粒子的表面或包埋在微球内部，一般为球形，直径在纳米到微米之间，受到激发光的激发可发出肉眼可见的荧光。
荧光微球形状和大小相对稳定，粒径均匀、单分散性好、发光效率高、重复性好，与生物体之间相互作用后产生的各种反应好，吸附性强、比表面积大、表面反应能力强和凝集作用大等。基本不受外界环境的影响，荧光物质的光学稳定性较好，需要通过免疫荧光分析仪读取荧光强度大小。荧光微球发射出来的荧光信号持续强而稳定，易于用仪器检测其荧光信号。
荧光免疫层析就是利用荧光微球表面修饰的功能基团（如羧基）与抗原或抗体等共价结合，通过荧光物质发出稳定而强的荧光信号从而进行定量检测。
总体来说，这3种免疫层析的标记物各有千秋。胶体金法和乳胶法的特点在于不需使用特殊仪器，肉眼即可判断，并且操作简便、检测时间短，其中乳胶法的显色能力更强，结果显示更直观。荧光免疫层析法相较于胶体金法、乳胶法而言灵敏度更高，但在使用的时候均需要配套的荧光检测器，目前没有居家使用型，仪器价格高。另外，荧光微球的成本较之于胶体金、乳胶高，可及性偏差。
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